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丹酚酸B應用

心血管疾病是一種嚴重威脅人類健康的疾病,該病具有“發病率高、致殘率高、死亡率高”等特點,目前已成為導致人類死亡的頭號病因。因此,尋找能夠有效治療心血管病的藥物成為了臨床面臨的首要問題。傳統的活血化瘀中藥丹參,因其具有祛瘀止痛、活血通經的功效,目前已被廣泛用于心血管疾病的治療。研究發現,丹酚酸(salvianolicacids)是丹參(拉丁學名:salviamiltiorrhizabunge)中含量最豐富的水溶性物質,而丹酚酸B則是丹酚酸中含量最多、生物活性最強的化合物。研究表明,丹酚酸不僅對心肌缺血/再灌注損傷具有保護作用,同時對心肌梗死及心肌細胞肥均有保護作用。

藥理作用及應用

1. 丹酚酸B在心血管疾病中作用

1)丹酚酸B對心肌梗死的保護作用:采用冠狀動脈結扎方法構建大鼠心肌梗死(myocardialinfarction,MI)模型,考察丹酚酸B對MI的保護作用。結果顯示,與對照組相比,丹酚酸B能夠對MI發揮明顯的心臟保護作用。機制研究表明,丹酚酸B主要通過抑制瘦素和內皮素-活性氧簇(ET-ROS)的上調以及恢復心肌中心肌細胞肌漿網鈣ATP酶2a(sarco/endoplasmicreticulumATPase2a,SERCA2a)和受磷蛋白的正常表達,進而發揮保護心臟的作用。

2)丹酚酸B對MI/R損傷的保護作用:MI/R時會產生大量自由基,使得細胞膜脂質過氧化反應增強,膜流動性和通透性發生改變,進而導致電生理活動異常,誘發和促進心律失常的產生。由于心肌細胞脂質過氧化反應增強,致使心肌缺血區的過氧化產物如丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量增多;冠脈流出液中乳酸脫氫酶(lacticdehydrogenase,LDH)和肌酸磷酸激酶(creatinephosphokinase,CPK)升高以及心肌組織中超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)減少。研究發現,丹酚酸B能夠明顯提高MI/R損傷大鼠心肌組織中的SOD活力,可有效對抗氧自由基引起的毒害作用,從而減輕心肌細胞的損傷。通過構建大鼠MI/R模型考察丹酚酸B對MI/R損傷的保護作用,發現與對照組相比,給予丹酚酸B能夠明顯增加血漿中肌鈣蛋白(troponins,CTn)、肌酸激酶同工酶(creatinekinase-MB,CK-MB)的含量,同時明顯降低血漿中一氧化氮(nitricoxide,NO)和總超氧化物歧化酶(totalsuperoxidedismutase,TSOD)的水平,表明丹酚酸B對大鼠MI/R損傷有明顯的保護作用。進一步研究發現,丹酚酸B能夠緩解氧化應激、減少鈣超載以及改善內皮功能。

3)丹酚酸B具有抑制心肌細胞肥大的作用:考察丹酚酸B對血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)誘導的新生大鼠心肌細胞肥大的影響,結果表明,丹酚酸B能夠抑制AngⅡ誘導的心肌細胞的肥大,同時發現心鈉素和腦鈉素mRNA表達下降及細胞表面積減少。機制研究發現,丹酚酸B能夠抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1]的活性;同時發現過表達PARP-1能夠減弱丹酚酸B抗心肌細胞肥大的效應,這些研究表明丹酚酸B具有很好的抑制心肌細胞肥大的作用。

4)丹酚酸B能夠抑制動脈粥樣硬化的形成:通過實驗考察了丹酚酸B對動脈粥樣硬化的作用,結果表明用丹酚酸B處理血管平滑肌細胞可有效抑制血小板衍生生長因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)誘導的細胞增殖和遷移,同時可明顯增加血紅素氧合酶1(hemeoxygenase-1,HO-1)的表達;與此同時,丹酚酸可明顯減少活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ROS)的產生及降低煙酰胺腺嘌呤二核

苷酸磷酸/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)的比率。用人臍靜脈內皮細胞研究發現,丹酚酸B能夠明顯誘導HO-1的產生,同時有效的抑制腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor,TNF-α)誘導的nuclearfactor-κB(NF-κB)的激活;而采用siRNA抑制HO-1的表達可消除丹酚酸對血管內皮細胞的保護作用,同時阻斷了HO-1缺失細胞的增殖、遷移和炎癥。進一步的機制研究表明,丹酚酸B是通過活化核因子E2相關因子(nuclearfactor-E2-relatedfactor2,Nrf2),進而誘導HO-1的表達,從而抑制血管細胞的增殖、遷移和炎癥,進而發揮抗動脈粥樣硬化的作用。

5)丹酚酸B能夠有效降低門靜脈高壓:采用內皮素1(endothelin-1,ET-1)誘導小鼠門靜脈高血壓,考察丹酚酸B對門脈高壓小鼠肝臟內血液微循環的影響,結果表明,與對照組相比,丹酚酸B能夠明顯降低門脈高壓小鼠肝臟內的平均血流和微循環流速,進而發揮降低門脈高壓的作用。研究表明,丹酚酸B能夠降低大鼠的門靜脈高壓,并且研究發現丹酚酸B主要是借助大鼠肝臟內的巨噬細胞而發揮作用。

2. 丹酚酸B調控心血管效應的機制

1)Akt-eNOS信號介導丹酚酸B對MI/R損傷的保護作用:研究發現,Akt-eNOS是再灌注損傷補救酶(reperfusioninjurysalvagekinase,RISK)信號轉導通路的組成之一,通過影響下游相關蛋白的表達,進而對心臟產生保護作用。在這一通路中,Akt處在中心環節,也是最主要的靶酶,只有磷酸化的Akt才能發揮一系列的生物活性。通過結扎冠狀動脈制備大鼠MI/R損傷模型,考察丹酚酸B對MI/R損傷大鼠的保護作用,研究表明,丹酚酸B可增加Akt的磷酸化水平進而導致其活化,活化的Akt進一步激活其下游靶標eNOS使其磷酸化,進而通過下游一系列的生物效應發揮對MI/R損傷的保護作用。

2)TLR4-NFκB-TNF-α炎癥通路介導丹酚酸B保護心肌細胞損傷:通過用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導新生大鼠心肌細胞炎癥損傷,并探討丹酚酸B對心肌細胞損傷的保護作用。結果發現,給予LPS后該組的乳酸脫氫酶和腫瘤壞死因子-α的濃度明顯高于其他組,表明造模成功;而給予丹酚酸B處理后,LDH和TNF-α的濃度明顯下降。與此同時,免疫組化結果顯示,給予LPS后,Toll樣受體4(toll-likereceptors,TLR4)和NF-κB的表達明顯升高;而給予丹酚酸B后,TR4和NF-κB的表達明顯下降。說明在用LPS誘導新生大鼠心肌細胞損傷的早期階段,TLR4-NF-κB-TNF-α通路被迅速激活,而丹酚酸B發揮保護心肌細胞損傷的作用,很可能是通過抑制該通路來實現的。

3)自噬介導丹酚酸B保護心肌細胞損傷:通過實驗考察自噬對饑餓心肌細胞的影響,同時觀察丹酚酸B對饑餓心肌細胞中自噬的效應。結果發現,心肌細胞饑餓3h后會誘發自噬,進而導致細胞損傷,并且發現饑餓細胞中的LC3-Ⅱ的表達呈現時間依賴性的增加;而給予丹酚酸B后,能夠明顯抑制LC3-Ⅱ的增加,同時細胞活力及心肌細胞中ATP的水平也明顯增加。該研究表明丹酚酸B能夠通過阻斷過度自噬,進而發揮保護作用。

4)線粒體凋亡途徑介導丹酚酸B抑制心肌梗死后心肌細胞的凋亡:通過結扎冠脈左前降支構建大鼠心肌梗死模型,進而考察丹酚酸B對心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡的影響。結果表明,丹酚酸B可以明顯降低心肌細胞的凋亡率。作者進一步考察丹酚酸B對凋亡相關基因表達的影響,結果發現丹酚酸B可以明顯降低Bax的表達,同時發現丹酚酸B也明顯降低了STAT-3及IL-6的表達。這表明線粒體凋亡途徑參與調控了丹酚酸B抑制心肌梗死后心肌細胞的凋亡。

制備[3-4]

方法1:一種高純度丹酚酸B的制備方法:

a.首先將中藥材丹參粉碎,第一次在去離子水100度微沸的條件下加入粉碎的丹參提取1小時,用丹參重量5倍量的水;然后在小于50度PH1—6.5的條件下提取2---3次,每次時間40分鐘,用丹參重量3倍量的水;

b.提取液過濾后通過大孔吸附樹脂層析,用水洗脫后,用20---90%的C1---C5的低級醇解吸,將解吸液減壓濃縮后,得到丹酚酸B的粗品;

c.丹酚酸B的粗品進一步經纖維素層析,以低級醇或丙酮洗脫,以水或C1---C5的低級醇解吸,合并含丹酚酸B的組分,減壓濃縮,冷凍干燥,得到高純度的丹酚酸B。

d.在a、b、c步驟中要用PH值調節物質將PH值調節至1—6.5。

方法2:一種采用鹽析制備高純度丹酚酸B的方法,包括以下步驟:

(1)將丹參粉碎后用醇溶劑、水或醇水混合液提取,過濾并減壓濃縮后獲得膏狀丹參粗提物;

(2)將膏狀丹參粗提物經過簡單的純化處理得到膏狀丹酚酸B粗提物;所述純化處理采用沉淀、萃取、大孔樹脂層析、正向色譜或反向色譜;沉淀法包括酸沉、水沉和醇沉,水沉是將水不溶的低極性雜質沉淀析出,醇沉是將醇不溶的雜質沉淀析出,酸沉是將酸性條件下不溶的雜質沉淀析出。大孔樹脂包括弱極性和非極性樹脂如D101、AB-8、HPD-100等。反相色譜填料包括反相硅膠和反相樹脂如C18硅膠、CG161、葡聚糖凝膠LH-20等。

(3)將膏狀丹參粗提物或膏狀丹酚酸B粗提物溶于有機溶劑,得到丹酚酸B粗溶液,在緩慢攪拌下滴加成鹽劑,成鹽pH為3-4,成鹽溫度為25-45℃,析出沉淀丹酚酸B鹽;所述丹酚酸B粗溶液中的含固量為10~30%(重量百分比),所述丹酚酸B粗溶液中丹酚酸B的重量百分比含量為5~80%,成鹽劑的摩爾量為丹酚酸B摩爾量的1-2.5倍,成鹽劑為弱堿溶液及鉀、鈉、鈣、鎂、氨、胺的有機鹽溶液或鉀、鈉、鈣、鎂、氨、胺的碳酸鹽溶液;所述有機溶劑選自甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、乙腈、四氫呋喃、二氧六環、二甲亞砜、甲酰胺或乙酸乙酯中一種或兩種,以乙酸乙酯和無水乙醇的混合溶液為佳;

(4)將丹酚酸B鹽經酸析脫鹽法、萃取脫鹽法或大孔樹脂層析脫鹽法脫鹽,干燥后獲得高純度的丹酚酸B。

主要參考資料

[1] 丹酚酸B在心血管疾病中藥理作用研究進展

[2] 丹酚酸B的藥動學及相關研究進展

[3] CN200710144939.5高純度丹酚酸B、制備方法及其應用

[4] CN201510167813.4一種采用鹽析制備高純度丹酚酸B的方法

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